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Direttore:
Prof. Gerry Melino
tel. 06.20.42.72.99
Modello strutturale
dell'enzima transglutaminasi 1. Le mutazioni indicate sono
responsabili della malattia Ittiosi Lamellare.
Il Laboratorio di Biochimica si occupa della
proliferazione delle cellule nella cute normale e nei tumori.
In particolare vengono studiate alcune proteine che regolano
il numero delle cellule (morte cellulare programmata o apoptosi)
e la loro velocita' di crescita. Essendo un laboratorio di
biochimica, l'interesse principale e' sulla ricerca di base,
ed infatti l'approccio usato coinvolge studi di biochimica,
biologia molecolare e biologia cellulare. Tali ricerche hanno
interesse clinico per le ittiosi ed i tumori neuroectodermici,
malattie per le quali il Laboratorio offre un supporto tecnico
ai Laboratori Diagnostici.
PERSONALE
Prof. Gerry Melino, direttore
Dr. Margherita Annicchiarico-Petruzzelli, assistente biologa
Dr. Maria Valeria Catani, assistente biologa
Dr. Alessandro Terrinoni, assistente biologo
COLLABORAZIONI
Prof. Irwing McLean, Genetics, Dundee, UK
Dr. Peter Steinert, Lab. Skin Biology, NIAMS, NIH, Bethesda,
MD, USA
Prof. R.A. Knight, Cystic Fibrosis Dept. NHLI, London, UK
Dr. Biagio Didona, I Divisione, IDI-IRCCS
Dr. Mauro Paradisi, VIII Divisione, IDI-IRCCS
ATTIVITA'
Attivita' 1: MORTE CELLULARE CUTANEA (ITTIOSI)
Il Laboratorio studia i meccanismi biochimici
della morte dei cheratinociti. Viene studiato il ruolo delle
transglutaminasi, e dei loro substrati (loricrina, tricoialina,
SPRs), nella formazione dell'involucro corneo.
Aree di interesse:
- Biochimica dell'Involucro Corneo.
Meccanismi biochimici della formazione dello strato corneo,
ed in particolare:
- ruolo delle TGasi (tipo 1, 2, 3, 5);
- ruolo dei substrati delle transglutaminasi
(loricrina, involucrina, SPRs).
- Malattie Genetiche dell'Involucro
Corneo. Raccolta delle famiglie ed identificazione delle
mutazioni per transglutaminasi e loro substrati:
- Ittiosi lamellare,
- Ittiosi volgare,
- Eritrocheratoderma,
- Nevo spongioso bianco,
- Nevo epidermico,
- Ipercheratosi palmoplantare.
STUDIO SULLE TRANSGLUTAMINASI, E RUOLO NELLA
ITTIOSI LAMELLARE
Un ruolo fondamentale nella costituzione dell'involucro
cellulare viene svolto dalle transglutaminasi 1, 2, 3 e 5
presenti negli ultimi strati dell'epidermide. Questi enzimi
Ca2+-dipendenti, catalizzando la formazione di legami crociati,
promuovono la formazione di macromolecole stabili e altamente
insolubili. In particolare, la transglutaminasi 1 e' associata
alla superficie interna della membrana dei cheratinociti.
Tale proteina sembra agire nelle prime fasi di formazione
dell'involucro corneificato, dando origine agli involucri
"di tipo fragile". Dall'analisi dell'espressione
del cDNA per la transglutaminasi 1 in sistemi modello procariotici
ed eucariotici studiamo differenti modificazioni post-traduzionali.
Inoltre, la transglutaminasi 1 ricombinante e' un enzima funzionale
in grado di formare legami isopeptidici utilizzando come substrati
proteine endogene quali ad esempio la loricrina e la tricoialina.
Stiamo conducendo ulteriori analisi al fine di comprendere
meglio le interazioni fra l'enzima e i suoi substrati. Viene
inoltre studiata la transglutaminasi 5 di recente identificazione,
e di cui manca la caratterizzazione biochimica.
Malati di Ittiosi Lamellare presentano mutazioni
della transglutaminasi 1. Si studiano tali mutazioni a livello
genetico e biochimico.
CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA DEI SUBSTRATI
DELLE TRANSGLUTAMINASI.
Loricrina, Tricoialina, SPRs e cheratine sono
substrati naturali delle transglutaminasi.
La loricrina e' una proteina espressa nello
strato granuloso dell'epidermide di mammiferi. E' quantitativamente
la maggior componente dell'involucro corneo come risulta dall'analisi
della sua composizione amminoacidica. Abbiamo espresso in
vitro e caratterizzata a livello biochimico la loricrina.
Esperimenti in vitro di crosslinks, condotti in collaborazione
con il Dr. P. Steinert (NIH, Bethesda, MD), mostrano che la
loricrina e' substrato specifico della transglutaminasi 3
ed 1. I residui usati nella formazione del legame isopeptidico
sono le Q 215, 216 e 219, e la K 315.
Abbiamo inoltre caratterizzato le proprieta'
biochimiche della tricoialina, espressa in E. coli. Essa e'
responsabile dell'interazione con altri filamenti intermedi
nei tessuti epidermici (bulbo pilifero). In particolare stiamo
studiando la struttura secondaria tramite spettroscopia di
dicroismo circolare. Le R sono trasformate post-traduzionalmente
in citrulline (tramite la peptidil-arginin deiminasi), provocando
unfolding.
Le Small Proline Rich proteins (SPRs) sono
di tipo 1, 2, e 3. Vengono studiate le proprieta' di substrato
in relazione alle transglutaminasi epidermiche.
Le cheratine di tipo I e II, non vengono studiate
a livello biochimico, ma genetico in collaborazione con Irwin
MacLean dell'Universita' di Dundee, UK.
Malati di Ittiosi (non Lamellare) presentano
mutazioni dei substrati delle transglutaminasi. Si studiano
tali mutazioni a livello genetico e biochimico.
Attivita' 2: APOPTOSI
Questo laboratorio studia la Morte Cellulare
(morte cellulare programmata o apoptosi) in modelli di tumori
neuroectodermici (es. melanoma). In particolare viene studiato
il ruolo della famiglia p53 (in particolare p73 e p63), e
della transglutaminasi 2 nella formazione dei corpi apoptotici.
L'approccio usato coinvolge studi di biochimica, biologia
molecolare e biologia cellulare. Aree di interesse:
- MECCANISMI BIOCHIMICI DELLA MORTE CELLULARE.
Identificazione dei meccanismi di apoptosi, ed in particolare:
ruolo di p73 e p63, ruolo della transglutaminasi 2 e sue
regolazioni da NO e retinoidi, ruolo della 5-Lipossigenasi.
- MALATTIE DEGENERATIVE. Apoptosi e degenerazione
nei tumori neuroectodermici (melanoma, neuroblastoma), meccanismo
degli UV e degli psoraleni, apoptosi nella psoriasi ed in
altre patologie degenerative.
STUDI SULLA FAMIGLIA p53 (p73 e p63)
L'apoptosi, o morte cellulare programmata,
e' un processo di suicidio fisiologico con caratteristiche
morfologiche e biochimiche distinte dalla necrosi. Le cellule
vengono trasformate in corpi apoptotici attraverso l'attivazione
di geni specifici. Studiamo la famiglia p53, ed in particolare
p73 e p63 nel danno al DNA. In particolare abbiamo identificato
diverse isoforme. Il gene p73 e' espresso in 6 varianti di
splicing (alfa - zeta) dal promotore principale ed altrettante
dal secondo promotore situato nel terzo introne. Questo codifica
per proteine senza il dominio di transattivazione, e quindi
per "dominant negative" naturali. Sono in corso
di caratterizzazione le proprieta' di legame e transattivazione
delle diverse isoforme. Abbiamo dimostrato, in collaborazione,
che p73 fa parte di una nuova via di induzione di apoptosi
da danno al DNA, indipendente e parallela a p53. Infine studiamo
il ruolo di p73 e p63 nel differenziamento.
STUDI SULLA TRANSGLUTAMINASI 2 E APOPTOSI
In collaborazione con Mauro Piacentini (Univ.
Tor Vergata, Roma) abbiamo dimostrato (attraverso trasfezioni
senso ed antisenso in modelli cellulari di tumori neuroectodermici)
che la transglutaminasi 2 determina la formazione di legami
crociati tra proteine, modifica irreversibilmente l'organizzazione
della cellula e determina alcuni cambi ultrastrutturali tipici
dei corpi apoptotici. La transglutaminasi 2 e' modulata dall'acido
retinoico ed ossido nitrico.
Per un dimostrazione definitiva del suo ruolo
in vivo abbiamo effettuato la distruzione genica della transglutaminasi
2 in topi transgenici. I topi sono in fase di caratterizzazione.
Attivita' 3: CELL DEATH
DIFFERENTIATION
Il Laboratorio di Biochimica gestisce la rivista
scientifica intitolata "Cell Death and Differentiation"
(CDD), di proprieta' IDI-IRCCS e pubblicata dalla Macmillan
Press (Nature-Publishing-Group, London. Impact Factor 4,733;
weblink: www.nature.com/cdd ).
PRINCIPALI PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE
- Richard G, De Laurenzi V, Didona B, Bale
SJ, Compton JG.
Keratin 13 point mutation underlies the hereditary mucosal
epithelia disorder white sponge nevus.
Nature Genetics. 1995. 11: 453-455.
- De Laurenzi V, Rogers G, Hamrock D, Marekov
L, Steinert PM, Compton J, Markova N, Rizzo B.
Sjogren-Larsson syndrome is caused by mutation in the fatty
aldehyde dehydrogenase gene.
Nature Genetics. 1996. 12: 52-57.
- Melino G, Bernassola F, Corasaniti MT,
Knight RA, Nistico G, Finazzi-Agro A.
S-nitrosylation regulates apoptosis.
Nature. 1997. 388: 432-433.
- Gong JG, Costanzo A, Yang HQ, Melino G,
Kaelin WG, Levrero M, Wang JYJ.
Regulation of the p53 homolog p73 by c-Abl tyrosine kinase
in cell death response to cisplatin.
Nature. 1999. 399: 806-809.
- De Laurenzi V, Melino G.
The little devil of death.
Nature. 2000. 406: 135-136.
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