Direttore: Prof. Gerry Melino
tel. 06.20.42.72.99

Il Laboratorio di Biochimica si occupa della proliferazione delle cellule nella cute normale e nei tumori. In particolare vengono studiate alcune proteine che regolano il numero delle cellule (morte cellulare programmata o apoptosi) e la loro velocita' di crescita. Essendo un laboratorio di biochimica, l'interesse principale e' sulla ricerca di base, ed infatti l'approccio usato coinvolge studi di biochimica, biologia molecolare e biologia cellulare. Tali ricerche hanno interesse clinico per le ittiosi ed i tumori neuroectodermici, malattie per le quali il Laboratorio offre un supporto tecnico ai Laboratori Diagnostici.

PERSONALEProf. Gerry Melino, direttore
Dr. Margherita Annicchiarico-Petruzzelli, assistente biologa
Dr. Maria Valeria Catani, assistente biologa
Dr. Alessandro Terrinoni, assistente biologo

COLLABORAZIONI
Prof. Irwing McLean, Genetics, Dundee, UK
Dr. Peter Steinert, Lab. Skin Biology, NIAMS, NIH, Bethesda, MD, USA
Prof. R.A. Knight, Cystic Fibrosis Dept. NHLI, London, UK
Dr. Biagio Didona, I Divisione, IDI-IRCCS

ATTIVITA'


Attivita' 1: MORTE CELLULARE CUTANEA (ITTIOSI)Il Laboratorio studia i meccanismi biochimici della morte dei cheratinociti. Viene studiato il ruolo delle transglutaminasi, e dei loro substrati (loricrina, tricoialina, SPRs), nella formazione dell'involucro corneo.

Aree di interesse:
* Biochimica dell'Involucro Corneo. Meccanismi biochimici della formazione dello strato corneo, ed in particolare:
o ruolo delle TGasi (tipo 1, 2, 3, 5);
o ruolo dei substrati delle transglutaminasi (loricrina, involucrina, SPRs).
* Malattie Genetiche dell'Involucro Corneo. Raccolta delle famiglie ed identificazione delle mutazioni per transglutaminasi e loro substrati:
o Ittiosi lamellare,
o Ittiosi volgare,
o Eritrocheratoderma,
o Nevo spongioso bianco,
o Nevo epidermico,
o Ipercheratosi palmoplantare.

STUDIO SULLE TRANSGLUTAMINASI, E RUOLO NELLA ITTIOSI LAMELLARE
Un ruolo fondamentale nella costituzione dell'involucro cellulare viene svolto dalle transglutaminasi 1, 2, 3 e 5 presenti negli ultimi strati dell'epidermide. Questi enzimi Ca2+-dipendenti, catalizzando la formazione di legami crociati, promuovono la formazione di macromolecole stabili e altamente insolubili. In particolare, la transglutaminasi 1 e' associata alla superficie interna della membrana dei cheratinociti. Tale proteina sembra agire nelle prime fasi di formazione dell'involucro corneificato, dando origine agli involucri "di tipo fragile". Dall'analisi dell'espressione del cDNA per la transglutaminasi 1 in sistemi modello procariotici ed eucariotici studiamo differenti modificazioni post-traduzionali. Inoltre, la transglutaminasi 1 ricombinante e' un enzima funzionale in grado di formare legami isopeptidici utilizzando come substrati proteine endogene quali ad esempio la loricrina e la tricoialina. Stiamo conducendo ulteriori analisi al fine di comprendere meglio le interazioni fra l'enzima e i suoi substrati. Viene inoltre studiata la transglutaminasi 5 di recente identificazione, e di cui manca la caratterizzazione biochimica.

Malati di Ittiosi Lamellare presentano mutazioni della transglutaminasi 1. Si studiano tali mutazioni a livello genetico e biochimico.

CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA DEI SUBSTRATI DELLE TRANSGLUTAMINASI.
Loricrina, Tricoialina, SPRs e cheratine sono substrati naturali delle transglutaminasi.
La loricrina e' una proteina espressa nello strato granuloso dell'epidermide di mammiferi. E' quantitativamente la maggior componente dell'involucro corneo come risulta dall'analisi della sua composizione amminoacidica. Abbiamo espresso in vitro e caratterizzata a livello biochimico la loricrina. Esperimenti in vitro di crosslinks, condotti in collaborazione con il Dr. P. Steinert (NIH, Bethesda, MD), mostrano che la loricrina e' substrato specifico della transglutaminasi 3 ed 1. I residui usati nella formazione del legame isopeptidico sono le Q 215, 216 e 219, e la K 315.

Abbiamo inoltre caratterizzato le proprieta' biochimiche della tricoialina, espressa in E. coli. Essa e' responsabile dell'interazione con altri filamenti intermedi nei tessuti epidermici (bulbo pilifero). In particolare stiamo studiando la struttura secondaria tramite spettroscopia di dicroismo circolare. Le R sono trasformate post-traduzionalmente in citrulline (tramite la peptidil-arginin deiminasi), provocando unfolding.

Le Small Proline Rich proteins (SPRs) sono di tipo 1, 2, e 3. Vengono studiate le proprieta' di substrato in relazione alle transglutaminasi epidermiche.

Le cheratine di tipo I e II, non vengono studiate a livello biochimico, ma genetico in collaborazione con Irwin MacLean dell'Universita' di Dundee, UK.
Malati di Ittiosi (non Lamellare) presentano mutazioni dei substrati delle transglutaminasi. Si studiano tali mutazioni a livello genetico e biochimico.

Attivita' 2: APOPTOSIQuesto laboratorio studia la Morte Cellulare (morte cellulare programmata o apoptosi) in modelli di tumori neuroectodermici (es. melanoma). In particolare viene studiato il ruolo della famiglia p53 (in particolare p73 e p63), e della transglutaminasi 2 nella formazione dei corpi apoptotici. L'approccio usato coinvolge studi di biochimica, biologia molecolare e biologia cellulare. Aree di interesse:

* MECCANISMI BIOCHIMICI DELLA MORTE CELLULARE. Identificazione dei meccanismi di apoptosi, ed in particolare: ruolo di p73 e p63, ruolo della transglutaminasi 2 e sue regolazioni da NO e retinoidi, ruolo della 5-Lipossigenasi.
* MALATTIE DEGENERATIVE. Apoptosi e degenerazione nei tumori neuroectodermici (melanoma, neuroblastoma), meccanismo degli UV e degli psoraleni, apoptosi nella psoriasi ed in altre patologie degenerative.

STUDI SULLA FAMIGLIA p53 (p73 e p63)

L'apoptosi, o morte cellulare programmata, e' un processo di suicidio fisiologico con caratteristiche morfologiche e biochimiche distinte dalla necrosi. Le cellule vengono trasformate in corpi apoptotici attraverso l'attivazione di geni specifici. Studiamo la famiglia p53, ed in particolare p73 e p63 nel danno al DNA. In particolare abbiamo identificato diverse isoforme. Il gene p73 e' espresso in 6 varianti di splicing (alfa - zeta) dal promotore principale ed altrettante dal secondo promotore situato nel terzo introne. Questo codifica per proteine senza il dominio di transattivazione, e quindi per "dominant negative" naturali. Sono in corso di caratterizzazione le proprieta' di legame e transattivazione delle diverse isoforme. Abbiamo dimostrato, in collaborazione, che p73 fa parte di una nuova via di induzione di apoptosi da danno al DNA, indipendente e parallela a p53. Infine studiamo il ruolo di p73 e p63 nel differenziamento.

STUDI SULLA TRANSGLUTAMINASI 2 E APOPTOSI
In collaborazione con Mauro Piacentini (Univ. Tor Vergata, Roma) abbiamo dimostrato (attraverso trasfezioni senso ed antisenso in modelli cellulari di tumori neuroectodermici) che la transglutaminasi 2 determina la formazione di legami crociati tra proteine, modifica irreversibilmente l'organizzazione della cellula e determina alcuni cambi ultrastrutturali tipici dei corpi apoptotici. La transglutaminasi 2 e' modulata dall'acido retinoico ed ossido nitrico.

Per un dimostrazione definitiva del suo ruolo in vivo abbiamo effettuato la distruzione genica della transglutaminasi 2 in topi transgenici. I topi sono in fase di caratterizzazione.

Attivita' 3: CELL DEATH DIFFERENTIATION
Il Laboratorio di Biochimica gestisce la rivista scientifica intitolata "Cell Death and Differentiation" (CDD), di proprieta' IDI-IRCCS e pubblicata dalla Macmillan Press (Nature-Publishing-Group, London. Impact Factor 4,733; weblink: www.nature.com/cdd ).

PRINCIPALI PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE
* Richard G, De Laurenzi V, Didona B, Bale SJ, Compton JG.
Keratin 13 point mutation underlies the hereditary mucosal epithelia disorder white sponge nevus.
Nature Genetics. 1995. 11: 453-455.
* De Laurenzi V, Rogers G, Hamrock D, Marekov L, Steinert PM, Compton J, Markova N, Rizzo B.
Sjogren-Larsson syndrome is caused by mutation in the fatty aldehyde dehydrogenase gene.
Nature Genetics. 1996. 12: 52-57.
* Melino G, Bernassola F, Corasaniti MT, Knight RA, Nistico G, Finazzi-Agro A.
S-nitrosylation regulates apoptosis.
Nature. 1997. 388: 432-433.
* Gong JG, Costanzo A, Yang HQ, Melino G, Kaelin WG, Levrero M, Wang JYJ.
Regulation of the p53 homolog p73 by c-Abl tyrosine kinase in cell death response to cisplatin.
Nature. 1999. 399: 806-809.
* De Laurenzi V, Melino G.
The little devil of death.
Nature. 2000. 406: 135-136.